Regulacion por PPAR de la expresion vascular de COX-2 asociada a la respuesta inflamatoria con la hipertension

Abstract

La hipertensión es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por niveles elevados de citoquinas proinflamatorias circulantes (Pauletto y Rattazzi, 2006; Savoia y Schiffrin, 2006; Marchesi y col., 2008) y de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Zalba y col., 2000; Beswick y col., 2001a; Zhou y col., 2003; Lee y Griendling, 2008), ambos eventos íntimamente relacionados con las alteraciones estructurales y funcionales observadas en esta patología. El estrés oxidativo activa factores de transcripción redox sensibles (Barchowsky y col., 1995; Bowie y O¿Neill, 2000) implicados en la expresión de citoquinas y de enzimas proinflamatorias (Roshak y col., 1996; Chun y Suhr, 2004; Tsatsanis y col., 2006), sugiriendo que la inflamación vascular observada en la hipertensión podría ser dependiente del incremento en los niveles de ROS. Entre las diferentes enzimas cuya actividad y expresión se encuentra incrementada en esta patología vascular está la isoforma inducible de la ciclooxigenasa (COX-2), principal objetivo de este estudio. Puesto que COX-2 se induce por diversos mediadores proinflamatorios (Sakai y col., 2001; El Haroun y col., 2004; Briones y col., 2005; Vila-del Sol y Fresno, 2005), además de por la producción de ROS (Peng y col., 2005) se puede establecer un nexo entre su expresión, el incremento en el estrés oxidativo y el estado inflamatorio vascular. Los prostanoides sintetizados por COX-2 pueden ejercer acciones proinflamatorias, indicando que alteraciones en la actividad de esta enzima y/o en su expresión podrían estar implicadas en las alteraciones funcionales y en la respuesta inflamatoria vascular observada en la hipertensión (García-Cohen y col., 2000; Adeagbo y col., 2005; Álvarez y col., 2005; 2007; Jaimes y col., 2008). La hipertensión se asocia con un incremento en la activación del sistema renina-angiotensina (RAS). La angiotensina II, principal péptido efector de este sistema, podría estar implicada en las alteraciones funcionales y estructurales relacionadas con la inflamación vascular asociada a la hipertensión debido a su capacidad para aumentar la síntesis de citoquinas proinflamatorias (Sanz-Rosa y col., 2005a; 2005b), incrementar el estrés oxidativo (Rajagopalan y col., 1996; Zalba y col., 2000; Pueyo y col., 2000; Seshiah y col., 2002; Zhou y col., 2003) e inducir la expresión de enzimas proinflamatorias como COX-2 (Ohnaka y col., 2000; Hu y col., 2002; Beltrán y col., 2009). Puesto que la angiotensina II lleva a cabo sus acciones proinflamatorias a través del incremento del estrés oxidativo y de la expresión de COX-2, las alteraciones en la expresión de esta enzima proinflamatoria descritas con la hipertensión podrían estar relacionadas con el incremento en la actividad del RAS. Los receptores activadores de la proliferación peroxisomal (PPARs) son receptores nucleares expresados a nivel vascular (Schiffrin y col., 2003; Hsueh y Bruemmer, 2004; Wu y col., 2004). En los últimos tiempos la importancia de los PPARs está creciendo debido a sus acciones antiinflamatorias y vasculares (Staels y col., 1998a; Jiang y col., 1998; Ricote y col., 1999; Ricote y Glass, 2007), sugiriendo que estos receptores nucleares podrían desempeñar un papel importante en el diseño de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de la hipertensión. Las acciones antiinflamatorias ejercidas por los PPARs pueden llevarse a cabo a través de la reducción del estrés oxidativo (Sung y col., 2006) y/o de la inhibición de la expresión de citoquinas o de enzimas proinflamatorias como COX-2 (Mendez y Lapointe, 2003; Cuzzocrea y col., 2004). Así, los PPARs podrían ser reguladores clave de la expresión de COX-2 inducida por el incremento de la actividad del RAS o por la exposición crónica a citoquinas proinflamatorias observada en la hipertensión. Los objetivos de este estudio han sido: 1) Analizar si la hipertensión produce alteraciones en la expresión vascular de COX-2 asociadas al incremento en la actividad del sistema renina angiotensina y si estas alteraciones se relacionan con los niveles de expresión de los receptores PPAR. 2) Determinar el papel de las especies reactivas de oxígeno sobre la expresión de COX-2 inducida por IL-1Q. 3) Analizar si los niveles de expresión de PPARg y/o su activación contribuyen a la regulación de la expresión de COX-2 y de otras enzimas implicadas en el estado inflamatorio vascular inducido por la IL-1Q y, si este efecto podría llevarse a cabo a través de mecanismos relacionados con la reducción del estrés oxidativo. En este estudio hemos utilizado segmentos de aorta torácica de ratas normotensas (WKY) e hipertensas (SHR) sin tratar y tratadas con el antagonista de los receptores AT-1 losartán (15 mg/Kg /día), en los cuales hemos llevado a cabo el análisis cuantitativo de los niveles de ARNm de los principales genes diana de este estudio utilizando RT-PCR. Además, se han utilizado cultivos primarios de células de músculo liso vascular (CMLV) de aorta procedentes de ratas SHR y WKY para analizar ¿in vitro¿ los efectos de angiotensina II e IL-1beta sobre la expresión de COX-2, así como el papel de los PPARs en la regulación de la expresión de COX-2 inducida por IL-beta. En estos cultivos hemos analizado los niveles de ARNm de COX-2 y otros genes implicados en el estrés oxidativo y la inflamación vascular por RT-PCR ¿a tiempo real¿, el efecto de los niveles de expresión de PPARg utilizando un ARN de interferencia específico y el efecto de la angiotensina II sobre la expresión proteica de COX-2 por western blot. Asímismo, se ha determinado la producción de O2.- y H2O2 tras el tratamiento con IL-1Q y el efecto de la activación de PPARg sobre la misma. Los principales hallazgos de este estudio son: 1) En la hipertensión existe un incremento en la expresión de la enzima proinflamatoria COX-2 asociado a la mayor actividad del sistema renina-angiotensina. La angiotensina II circulante contribuye al incremento de la expresión vascular de COX-2 observada en la hipertensión, a través de la activación de los receptores AT-1. 2) El incremento en la expresión de COX-2 inducido por angiotensina II se asocia con el incremento en el estrés oxidativo, como consecuencia de la inducción de la expresión de la subunidad catalítica la NAD(P)Hox NOX-1 y, probablemente, del aumento en la actividad de este complejo enzimático. 3) En la hipertensión no se modifica la expresión de PPARa, mientras que la de PPARg está reducida, probablemente, como consecuencia del incremento en la activación del RAS observado en esta patología vascular. Los menores niveles de expresión de PPARg podrían estar implicados en el incremento de la expresión de COX-2 previamente descrito. 4) De acuerdo con el estado inflamatorio vascular asociado a la hipertensión, el incremento en la transcripción de COX-2 inducido por mediadores proinflamatorios como la IL-1beta es mayor en CMLV de animales hipertensos. 5) La inflamación vascular contribuye al incremento en el estrés oxidativo descrito en la hipertensión. Así, la exposición de CMLV procedentes de animales hipertensos a IL-1beta incrementa los niveles de O2.- y H2O2, como consecuencia del incremento en la expresión de NOX-1 y/o en la actividad de la NAD(P)Hox. Estas especies reactivas de oxígeno contribuyen a la inducción de COX-2 en CMLV de animales hipertensos estimulados con esta citoquina. 6) El estrés oxidativo inducido por IL-1beta en CMLV de animales hipertensos también activa mecanismos antioxidantes como la expresión de las enzimas detoxificantes SODs o la catalasa. 7) La activación de PPARg, pero no de PPARa, induce su propia expresión y reduce la expresión de COX-2 inducida por IL-1Q en CMLV de ratas SHR por inhibición de la transcripción de NOX-1inducida por la citoquina y, por consiguiente, por reducción de los niveles de ROS derivados de la NAD(P)Hox. 8)La IL-1beta también induce la expresión de PPARg en CMLV de animales hipertensos por un mecanismo dependiente de la producción de H2O2. El aumento en la expresión de PPARg constituye un mecanismo antioxidante y antiinflamatorio endógeno implicado en la inducción de enzimas detoxificantes como la catalasa y en la inhibición de la expresión de enzimas prooxidantes como NOX-1 y, por tanto, explicaría la inhibición de la expresión de COX-2 inducida por citoquinas proinflamatorias tras la activación de dicho receptor. En conclusión, los resultados obtenidos en este estudio sugieren que PPARg desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta inflamatoria vascular. Los efectos observados con el activador de PPARg pioglitazona en CMLV de SHR confirman que este receptor es clave en la reducción de la producción de ROS inducida por citoquinas y en la expresión de enzimas proinflamatorias como COX-2. Como hemos demostrado, el incremento en la activación del RAS observado en ratas SHR está implicado en la reducción de los niveles de PPARg observada en esta cepa. Los menores niveles de expresión de este receptor nuclear suponen una reducción en un mecanismo endógeno protector frente al incremento en el estrés oxidativo y la respuesta inflamatoria vascular inducida por los elevados niveles de citoquinas proinflamatorias descritos en la hipertensión. Además, el aumento en la expresión de COX-2 asociado a los menores niveles de PPARg en ratas SHR mostrado en este estudio podría ayudar a explicar algunas de las alteraciones funcionales y estructurales descritas en la patología hipertensiva.