Comparison of methods and characterization of small RNAs from plasma extracellular vesicles of HIV/HCV coinfected patients.

Abstract

El virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) secuestran la maquinaria exosomal del huésped como un mecanismo adicional de infección y evasión del sistema inmunitario, modificando la carga de pequeños ARN (smRNA) durante la infección. Caracterizamos los epítopos de superficie de las vesículas extracelulares (VE) del plasma de pacientes coinfectados con VIH/VHC y el perfil de su carga de smRNA, comparando distintos procedimientos de aislamiento. Se compararon seis métodos de aislamiento de VE: ultracentrifugación y cinco métodos diferentes basados en polietilenglicol (uno comercial, uno combinado con un paso de purificación por columna y dos personalizados); además, se utilizaron dos kits comerciales para la extracción de ARN (basados en fenol y no basados en fenol). Se realizó secuenciación de alto rendimiento de smRNA. Los epítopos de superficie exosomal se analizaron mediante el kit MACSPlex Exosome. Cuatro miARN mostraron diferencias entre los protocolos (hsa-miR-205-5p y hsa-let-7a/b/f-5p). La selección del kit de aislamiento de ARN influyó en la detección de miARN y otros smRNA; el kit basado en fenol mostró un rendimiento aceptable. La superficie de las VE estuvo enriquecida con HLA-DR/DP/DQ, CD81 y CD8. Se observaron tres miARN específicos del hígado sobreexpresados (let-7a-5p, miR-21-5p y hsa-miR-122-5p), lo que sugiere que la carga de las VE podría reflejar la evolución de la enfermedad hepática. También se detectaron por primera vez otros smRNA, como los ARN asociados a piwi. Los métodos personalizados basados en precipitación con polietilenglicol, combinados con un kit de ARN basado en fenol, produjeron el mayor número de smRNA en las VE aisladas del plasma de pacientes con VIH/VHC.