TECNOLOGÍA CRISPR-CAS

Abstract

Los sistemas de edición genética están adquiriendo una gran importancia en múltiples aplicaciones, como la creación de modelos de investigación, la búsqueda de nuevos tratamientos o la generación de organismos transgénicos. La técnica CRISPR-Cas9 gracias a sus ventajas está cobrando gran popularidad, y cuenta con múltiples usos, por ejemplo, la creación de modelos knock out para el estudio de genes o proteínas. El objetivo de este proyecto ha sido crear un modelo knock out en podocitos de ratón para el estudio de la función de TGFB3 en estas células. El estudio de esta familia de proteínas tiene gran importancia debido a su posible papel profibrótico en los podocitos y su relación con las enfermedades renales crónicas. Estas patologías representan una carga creciente para la salud pública, con una prevalencia en aumento debido al envejecimiento de la población y al incremento de condiciones predisponentes como la diabetes y la hipertensión. Para desarrollar este objetivo, se han creado lentivirus portadores de los componentes del sistema CRISPR-Cas9 que se han utilizado como vectores para introducir estos componentes en los podocitos murinos. Se han utilizado dos ARN guías diferentes que han permitido crear dos modelos distintos y además, para el control de la infección se han usado lentivirus que poseían el gen de GFP. Con el fin de medir los efectos en los niveles de las proteínas diana se han empleado técnicas como la inmunodetección o la microscopia de fluorescencia. Los resultados obtenidos demuestran la capacidad de los lentivirus para infectar correctamente las células, así como la correcta incorporación de los genes, como se observa con la resistencia a los antibióticos o la fluorescencia de las células infectadas que expresan GFP. De los componentes de CRISPR-Cas9 la expresión de la proteína Cas9 es positiva, sin embargo, solo en uno de los modelos se obtuvo una reducción en los niveles de expresión de TGFB3. Esta tecnología tiene un gran potencial para la edición genética, donde en un primer experimento se ha conseguido reducir un 40% la expresión de TGFB3, sentando las bases para su perfeccionamiento y potencial uso para el estudio proteico.