AISLAMIENTO SELECTIVO EN PLASMA DE RATÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES CIRCULANTES ORIGINADAS POR TIPOS CELULARES ESPECÍFICOS.

Abstract

A pesar del creciente interés sobre las vesículas extracelulares (VEs) por su papel en la comunicación celular y como potenciales biomarcadores para el diagnóstico temprano de enfermedades, a día de hoy no existe un consenso sobre la técnica más adecuada para el aislamiento de estas vesículas. El objetivo del presente estudio fue desarrollar un protocolo de aislamiento a partir de plasma de ratón de VEs producidas por hepatocitos lo suficientemente puras para examinar su contenido de microRNAs libre de contaminantes externos como proteínas solubles u otras vesículas, así como evaluar la utilidad del miR-122-5p como indicador del origen en hepatocitos. Para ello, se utilizó una cepa transgénica de ratón portador de doble fluorescencia (AlbCre x mT/mG) en donde los hepatocitos presentan fluorescencia eGFP (verde) y el resto de las células fluorescencia mT (rojas). Para el aislamiento de las VEs marcadas con eGFP, combinamos secuencialmente las técnicas de cromatografía de exclusión por tamaño y de selección inmuno-magnética con beads anti-GFP, y evaluamos diversos protocolos de digestión con proteinasa K y RNasa y de preaclarado con beads desnudas. Los resultados del trabajo sugieren la existencia de una considerable contaminación por microRNAs solubles en los aislados con las beads anti-GFP y que la mayor proporción del miR-122-5p presente en el plasma circula en forma soluble y no en el interior de las VEs.