Desarrollo de bioensayos y biomarcadores para la evaluación del estrés abiótico y la toxicidad ambiental

Abstract

Las actividades humanas producen una alteración en los ecosistemas a través de los cambios en las comunidades, la fragmentación de los hábitats y la contaminación química. En los últimos años ha aumentado de manera creciente la preocupación mundial sobre la presencia de contaminantes emergentes puesto que las tecnologías utilizadas actualmente no consiguen eliminarlas de manera completa. Los contaminantes y sobre todo los microcontaminantes no tienen por qué causar letalidad en los organismos en concentraciones ambientales. Sin embargo, pueden tener efectos crónicos en los organismos, poniendo en riesgo la viabilidad de las poblaciones. En la evaluación de la contaminación ambiental se han utilizados diversas técnicas. Los análisis químicos nos permiten caracterizar los productos químicos en el medio, pero no determinan sus procesos de degradación ni la posible sinergia entre ellos.Tampoco tienen en cuenta la biodisponibilidad.La evaluación mediantebioindicadores puede llevar más tiempo y ser más costoso que hacer un seguimiento de los indicadores abióticos. Ambas herramientas tienen un carácter diagnóstico más que pronóstico del estado del ecosistema y no permitenanticiparse a daños irreversibles. Los bioensayos por otra parte sípermiten monitorizar la calidad ambiental,pero utilizan pocos taxones, obteniendo resultados poco relevantes y no extrapolables a otras especies similares, especialmente en el medio terrestre. Para que la protección del ecosistema sea total, se necesitan muchos ejemplares por lo que la duración y coste de estos estudios aumentan. Los biomarcadores son una herramienta útil para evaluar la contaminación y sus posibles efectos en la biota. Son cambios suborgánicos que se producen en un organismo, es decir a nivel bioquímico, celular, molecular o fisiológico y que son indicativos de la exposición y/o efecto de un contaminante. Medidos a nivel molecular/celular permiten su utilización de manerapredictiva. La presente tesis doctoral pretender contribuir al desarrollo de herramientas de diagnóstico ambiental más sensibles, fiables, rápidas, de bajo coste y con carácter pronóstico. Una de estas herramientas es la evaluación del uso de biomarcadores de campo para detectar contaminantes persistentes en sedimentos y bioacumulativos en la biota. Con este objetivo,se seleccionaron diferentes puntos de muestreo, a lo largo de dos arroyos que atraviesan una zona agrícola de regadío. Se evaluaron los niveles de peroxidación lipídica en varios órganos de cangrejo de río americano (Procambarus clarkii)y en las hojas de dos especies leñosas de sauce y encina (Salix sppy Quercus rotundifolia). La determinación de los niveles de MDA (malonaldehído) mediante el ensayo de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico permitió medir los niveles de peroxidación lipídica. Se observaron diferencias en los niveles de peroxidación lipídica en individuos de P.clarkiirecogidos en diferentes puntos de muestreo, sin embargo estas diferencias variaban según el órgano (si se tenían en cuenta también las variaciones debidas al sexo).Se comprobaron niveles de peroxidación lipídica en las branquias de los machos de cangrejorojo americano aguas abajo de la zona de riego y en las hojas de encina recolectadas en una zona de drenaje de un campo de arroz. El índice MDA-branquias/MDA-hepatopáncreaspermitió distinguir entre los sitios de referencia y los contaminados. La peroxidación lipídica puede ser por tanto un biomarcador de campo adecuado para evaluación de la contaminación ambiental y permite gestionar de manera más eficiente la contaminación agrícola difusa. Otra herramienta sería el desarrollo de un microbioensayo rápido que pueda detectar contaminantes persistentes en aguas superficiales y aquellas formas de metales pesados que al liberarse al medio ambiente son muy tóxicas.Con el fin de desarrollar este microbioensayo, se cultivó el alga liquénica Asterochloris ericide forma axénica sobrepapel de celulosa tratado químicamente, se deshidratóy se rehidratócon diferentes concentraciones de los contaminantes dicromato de potasio, sulfato de cobre, ácido bórico y ácido clofíbrico. Se midió la autofluorescencia de la clorofila y el contenido de radicales libres 5 minutos después de la rehidratación. También se analizaron imágenes microscópicas de fluorescencia de los ficobiontes expuestos.Las concentraciones altas de dicromato de potasio y desulfato de cobre disminuyeron la autofluorescencia de la clorofila, mientras que el ácido bórico y el ácido clofíbrico tuvieron poco efecto. Los metales pesados indujeron estallidos de radicales libres en concentraciones extremadamente bajas mientras que el ácido bórico y el ácido clofíbrico provocaron aumentos modestos y fluctuantes. En todos los casos, las LOEC de los radicales libres son menores que los de la autofluorescencia de la clorofila en al menos tres órdenes de magnitud, lo que hace que este microbioensayo sea altamente sensible y rápido, así como de bajo coste y ecológicamente relevante. Los ecosistemas terrestres están más representados gracias al uso de este microalga aéreo-terrestre. Y, por último, se desarrollóun estudio que analiza el potencial de la espectrometría de infrarrojo cercano con transformada de Fourier (FT-NIRS)como método alternativopara la detección de biomarcadores de estrés ambiental.Esta técnica permite el análisis del estado metabólico de las células, proporcionando una huella dactilar molecular única y permite asociar cambios metabolómicos con situaciones de estrés. En particular, permite analizar en profundidad la estructura del agua y su papel en los sistemas biológicosconstituyendo la novedosa acuafotómica.Para este análisis se curva de deshidratación de los ficobiontes y se obtuvieron los espectros NIRS de Asterochloris ericien el proceso de deshidrataciónen atmósfera de gel de sílicey tras la rehidratación. Se comprobó que los A. erici estabiliza su contenido relativo de agua en un 16 % después de 180 minutos. Al comparar el espectro de las algas frescas con las algas deshidratadas, estás ultimas tenían mayor absorbancia de lípidos saturados y proteínas Por otro lado, las algas rehidratadas durante 24 horas con agua desionizada no mostraban muchas diferencias con respecto a las algas frescas, pero había mayor absorción de aminas y proteínas. No encontramosdiferenciasapreciablesentre los espectros de algas frescas y rehidratadas tras 48 horasen la huella molecular global. Mediante acuafotómica se estudiaron seis especies moleculares de agua: cúmulos catiónicos (Sr, 1346 nm), agua libre (S0 , 1403 nm), agua con un enlace de hidrógeno (S1 ,1440 nm), dos (S2 , 1464 nm), tres (S3 , 1490 nm) ycuatro(S4 , 1650 nm). Según avanza la deshidratación, disminuyen las moléculas de agua libre y aumentan las moléculas con puentes de hidrogeno. Un descenso brusco de S0 a los 100 minutos y el aumento de S1parecen indicar la preparación para la anhidrobiosis.La absorbancia relativa de estas especies en la deshidratación en atmosfera cerrada es diferente a la que aparece en la liofilización. El estudio de las moléculas de agua nos facilita comprender los mecanismos de tolerancia a la deshidratación