Método de Microscopía Electrónica de Barrido "block face" (BFSEM). Estudio con microanálisis por dispersión de energías de Rayos X

Abstract

La metodología denominada Block Face Scanning Electron Microscopy ha supuesto un gran avance en el campo de la Volume Electron Microscopy contribuyendo de forma espectacular a la realización de reconstrucciones tridimensionales de la ultraestructura particularmente del tejido nervioso. Esta metodología exige que las muestras de tejido estén tratadas de manera que se puedan obtenerse imágenes con un alto contraste. Para ello los investigadores han aplicado de manera empírica las técnicas clásicas de contrastado que se utilizan en microscopia electrónica de transmisión. En el presente estudio se ha investigado la conducta de las sales de diversos metales pesados como elementos que otorgan contraste a células y tejidos. Para ello se han diseñado diversos protocolos en los que intervienen dos sustancias clásicas en microscopía electrónica: el tetróxido de osmio y el permanganato potásico. Además a estas dos sustancias se han añadido otras como el acetato de uranilo y el ácido fosfowolfrámico. Los mejores resultados han sido obtenidos con el tetróxido de osmio y mediante estrategias que incrementan su depósito en las estructuras tisulares. Estos resultados también mejoran ostensiblemente si además se añaden al osmio metales de elevado número atómico como son el uranio o el wolframio, mostrando estos elementos una mayor afinidad por las estructuras en función de la cantidad de osmio que se haya depositado previamente en ellas. Sin embargo, los tratamientos con permanganato dan resultados aceptables pero de menor calidad que con el osmio. Asimismo en el presente trabajo para la determinación de las condiciones óptimas para BFSEM se han utilizado varias herramientas entre las que se encuentran la espectrometría dispersiva de Rayos X, la Signal/noise ratio (SNR),y la técnica de Beam deceleration. La aplicación de técnicas de microanálisis de espectrometría dispersiva de rayos X han sido de crucial importancia para estudiar la localización subcelular de los depósitos metálicos después de contrastar las muestras y para determinar las concentraciones relativas de dichos metales obteniendo un análisis cuantitativo de los mismos. La calidad de imagen ha sido determinada en términos de la relación señal/ruido (SNR), observando que cuanto mayor es el depósito de metales pesados en la estructura se obtienen mejores resultados de SNR, lo que concuerda con examen visual de las imágenes. Adicionalmente se han llevado a cabo ensayos para la obtención de imagen aplicando la llamada Beam deceleration, una estrategia que en nuestro caso, teniendo en cuenta las condiciones de trabajo con el microscopio electrónico de barrido, ha dado en parte buenos resultados. La posible influencia de los recubrimientos conductores sobre la calidad de la imagen también ha sido investigada en este trabajo, demostrándose que el recubrimiento mediante con platino o carbono son los mejores como así lo demuestran las medidas de SNR. Se ha demostrado que la topografía de la superficie del bloque afecta a la calidad de la imagen en la medida en que estrías, huecos y otros artefactos por muy microscópicos que sean, perturban la imagen. Para ello se han comparado la preparación de la superficie del bloque con cuchillas de vidrio y de diamante, siendo esta última la que produce las superficies requeridas para BFSEM. Hasta ahora BFSEM, gracias a la posibilidad de realizar series de cortes, goza de una amplia aplicación en neurobiología para la consecución de reconstrucciones tridimensionales de la ultraestructura que de otra manera no serían posibles. En nuestro trabajo hemos demostrado que también podría tener aplicaciones en Histología general y patológica. En este caso se puede prescindir de la realización de cortes en serie, pudiendo ser examinada "toda" la superficie del bloque, ya que en BFSEM no es necesario tallar en exceso el bloque que contiene la muestra. Este último aspecto podría ser de gran interés para el diagnóstico histopatológico (Biopsias).